组蛋白修饰与表观遗传学讲义

CMU2022组蛋白修饰与表观遗传学讲义

基础：重要的概念和理论

• 核小体、染色质、组蛋白密码及修饰

  • 核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白构成，是染色质的基本结构单位。由几种组蛋白:H1(H5)、H2A、H2B、H3和H4组成，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。

  • DNA以染色质的形式存在，染色质通常由DNA、组蛋白、非组蛋白以及少量RNA包装而成，其中组蛋白是染色质的基本结构蛋白。

  • 组蛋白的N-末端可通过共价作用从而发生化学基团修饰，这些修饰的信息构成了丰富的组蛋白密码，其中乙酰化和甲基化是最为重要的修饰方式。

• 染色体与基因结构的修饰

  • DNA水平：DNA序列，DNA甲基化

  • 核小体水平：核小体组装，组蛋白修饰

    组蛋白修饰包括：乙酰化作用、甲基化、磷酸化作用、ADP核糖基化、泛素化、Sumolation

  • 染色质水平：ATP依赖性染色质重塑 ATP-dependent chromatin remodeling

• 基因表达的调节：在基因表达过程中，从DNA经过RNA到蛋白质表达的各个阶段都可受到调控：

  1. 转录调控 transcriptional control

  2. RNA处理调控 RNA processing control

  3. RNA转位调控 RNA transport control

  4. 翻译调控 translational control

  5. mRNA代谢调控 mRNA degradation control

  6. 蛋白质活动调控 protein activity control

表观遗传学：概念及工具

The new field of epigenetics is showing how your environment and your choices can influence your genetic code—and that of your kids.

• 概念： 基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达水平与功能发生改变，并产生可遗传的表型。不依赖于DNA序列的遗传现象。 ** 特征: ** (1)可遗传，(2)可逆性，(3)DNA不变

• 表观遗传学研究的模式生物

  1. 哺乳动物

  2. 果蝇

  3. 线虫

  4. 玉米

  5. 拟南芥

  6. 四膜虫

  7. 裂殖酵母

  8. 酿酒酵母

  9. 链孢霉

• Position Effect Variegation,PEV model : 花斑型位置效应,常染色质区内的显性基因易位到异染色质区后表达受抑制,导致某些细胞中显性和隐性性状出现镶谍斑双的遗传现象。位置效应变异（PEV）是一种基因表达的长程调节机制，由此基因组重排高达400kb导致染色质结构的局部破坏，从而导致转录机制的进入(reviewed in Bedell et al., 1996).

• 表观遗传学的研究内容: 从现在的研究情况来看，表观遗传学变化主要集中在三大方面

  • DNA甲基化修饰:基因选择性转录表达的调控

  • 非编码RNA的调控作用:基因转录后的调控，miRNA、RNA干扰

  • 组蛋白修饰:蛋白质的翻译后修饰

  • 染色质水平：染色质重塑

• 表观遗传学的研究意义

  1. 表观坦传学补充了“中心法则”所和起略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体。

  2. 表观遗传信息可以通过控制基因的表达时间、空间和方式来调控各种生理反应。所以许多用DNA序列不能解释的现象都能够找到答案。

  3. 与DNA序列的改变不同，许多表观遗传的改变是可逆的，这使表观遗传疾病的治念成为可能。

化学修饰的机制和研究策略

DNA甲基化 DNA methylation

• DNA甲基化与表型影响

  1. DNA甲基化: 基因沉默(gene silence)

  2. 非甲基化(non-methylation): 基因活化(gene activation)

  3. 去甲基化: 沉默基因的重新激活

• 表型机制：

  • DNA甲基化模式可以在DNA复制后被保持下来，DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状态。

  • DNA甲基化的部位通常在CpG岛的胞喀啶，GpC岛通常分布在基因的启动子区

  • CpG岛的甲基化会稳定核小体之间的紧密结合而抑制基因的表达。

  • 当一个基因的启动子序列中的CpG岛被甲基化以后，尽管基因序列没有发生改变，但基因不能启动转录，也就不能发挥功能，导致生物表型的改变。

• DNA甲基化机制：

  参考文献：

  1. Identification of DNA motifs that regulate DNA methylation

  2. nature review cancer

  • DNA methylation plays crucial roles in many biological processes, and aberrant DNA methylation patterns are often observed in diseases.

  • DNA methylase, DNMTs:DNMT1/3A/3B

  Three DNA methyltransferases(DNMTs) in human that are responsible for denovo or maintaining methylation of cytosine.

  • DNA binding proteins or non-coding RNAs recognize specific DNA motifs and their binding recruits DNMTs to a particular locus to methylate cytosines in the region.

• DNA甲基化的研究策略

  • Measurement of DNA Methylation methylation sensitive restriction enzymes to digest DNA followed by Southern detection or PCR amplification bisulfite reaction based methods have become very popular such as methylation specific PCR(MSP), bisulfite genomic sequencing PCR

    In order to identify unknown methylation hot-spots or methylated CpG islands in the genome, several of genome-wide screen methods have been invented such as Restriction Landmark Genomic Scanning for Methylation(RLGS-M), and CpG island microarray

  • Applications of DNA Methylation Detection of the level of DNA methylation on promoters of tumor-related genes maybe useful for cancer diagnosis or tumor recurrence.

    Identification of unknown methylation hot-spots or methylated CpG islands in the genome will be useful to find some novel genes related with diseases.

染色质重塑 Chromatin modification 与组蛋白修饰 Histone modification

动态的染色质重塑过程是大多数以DNA为寞放的生物学过程的基础，如基因的转录、DNA的复制与修复等等，而这些生物学过程的混乱都与疾病的发生、发展直接相关，因此米色质重塑不仅能够调节基因的转录，同时还参与了与疾病发生密切相关的那些基础细胞生理过程。

染色质重塑(chromatin remodeling)是一个重要的表观遗传学机制。是由染色质重塑复合 物介导的一系列以染色质结构变化(alteration of chromatin structure)为基本特征的生物学过程。

染色质重塑包括组蛋白修饰和ATP-dependent染色质重塑因子参与的染色质结构变化过程。以下内容主要围绕组蛋白修饰进行：

• 组蛋白修饰种类与表型

  参考文献：

  1. The language of covalent histone modifications

  • 乙酰化：一般与活化的染色质构型相关联，乙酰化修饰大多发生在H3、H4的Lys残基上。

  • 甲基化：发生在H3、H4的Lys和Asp残基上，可以与基因抑制有关，也可以与基因的激活相关，这往往取决于被修饰的位置和程度。

  • 磷酸化：发生在Ser残基，一般与基因活化相关。

  • 泛素化：一般是C端Lys修饰，启动基因表达。

  • SUMO(一种类泛素蛋白)化：可稳定异染色质。

  • 其他修饰

    组成核小体的组蛋白可以被多种化合物所修饰，如磷酸化、乙酰化和甲基化等，组 蛋白的这类结构修饰可使染色质的构型发生改变，称为染色质构型重塑。

• 组蛋白修饰-表型及可遗传机制

  组蛋白中被修饰氨基酸的种类、位置和修饰类型被称为组蛋白密码(histone code)，决定了基因表达调控的状态，并且可遗传。

参考文献：

Kouzarides T.“Chromatinmodificationsandtheirfunction”Coll(2007)128:693-705.（table1）

• 组蛋白修饰分子机制

  • 组蛋白乙酰化：由组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰基酶(HDAC)协调催化完成，修饰的部位一般位于N末端保守的赖氨酸残基上。是一个可逆的动力学过程，可以调节基因的转录。中和AA的正电荷，C=O只有一定的负电，能够增加与DNA的太力，使得DNA结构得疏松，从而导致基因的转录活化

    组蛋白修饰主要是氨基端的甲基化修饰和(或)乙酰化修饰，特定组蛋白的氨基酸残基被甲基化和乙酰化也可抑制基因表达。

  • 组蛋白甲基化: 多发生于组蛋白H3、H4的赖氨酸(3位点)和精氮酸(2位点)残基上，由特异的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(HMT)催化完成，也是一个可调控的动态修饰过程。而组蛋白的去甲基化是由赖氨酸去甲基酶(LSD1)催化完成。

  • 组蛋白泛素化：特定组蛋白羧基端的泛素化影响蛋白质的降解过程，从而也可调节基因的表达。组蛋白泛素化由E1、E2、E3级联酶催化修饰，也是一个可逆的动力学过程。

  • 组蛋白修饰间的相互作用:

    组蛋白的各种修饰不是相互独立的，而是互相作用，所有组蛋白都可以磷酸化化，而H3-K9的甲基化则会阻止H3-Ser10的磷酸化。

  • 组蛋白修饰的相关蛋白和特征

    • 修饰结合蛋白质:组蛋白密码的阅读器

    • 组蛋白密码的组合方式

    • 不同组重白的修饰组合起来发挥功能；

    目前研究还发现组蛋白修饰与CpG岛的甲基化相关 Histone modification crosstalk; DNA methylation and Histone modification crosstalk

    • Histone code composed of histone modifications(PTM) directs the chromatin state.

    • Among the histone PTMs, methylations are most pivotal.

    • Histone modifiers (histone PTM enzymes) and chromatin remodel ers are epigenetic regulators.

• 组重白修饰的研究策略

  • Measurement of Histone modification

    • 染色质免疫沉淀技术(ChromatinImmunoprecipitation,ChlP) 是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。ChlP可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系

      ChlP技术的基本原理:活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物将其随机切断为一定长度的染色质小片段通过免疫学方法沉淀复合体，特异性的富集目的蛋白结合的DNA片段,检测并获得与DNA相互作用的信息(qPCR)

    • MNase Assay

    • Specific histone modification assay in vitro

• Applications of histone modification Detection of the level of histone modification on promoters of genes would be crucial for understanding the mechanisms of gene transcription,and it would bea useful marker for tumor diagnosis and recurrence.

RNA干扰 RNA interfering 与非编码RNA的调控作用

在近几年的生命科学研究中，从06年诺奖的siRNA，到这几年异常火爆microRNA，到即将登场并定能风靡的IncRNA，非编码调控RNA无疑是研究最火的领域之一。

研究发现，RNA不仅仅只承担遗传信息中间载体的辅助性角色，而是更多地承担了各种调控功能。

功能性非编码RNA在表观站传修饰中发挥极其重要的作用。ncRNA按照大小可分为 两类长链非编码RNA和短链非编码RNA。

长链非编码RNA在基因狭乃至于整个染色体水平上发挥顺式调节作用，短链RNA在 基因组水平对基因的表达进行调控°

• RNA干扰(RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA分子在mRNA水平上诱导特异性序列基因沉默的过程.

• 由于RNAi发生在转录后水平，所以又称为转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PIGS).

• RNA干扰是一种重要而普遍表观遗传学的现象.

常用的ncRNA的检测研究方法及应用

1. RNA sequence/Genemicro array

2. Idendification of target genes of ncRNA

3. Functional analysis of target genes in the related diseases

m6ARNA methylation

参考文献：

RNA N-methyladenosine methylation in post-transcriptional geneexpression regulation

Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications Where,when and how:context-dependent functions of RNA methylation writers,readers,and erasers RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression

Cellular RNAs are naturally decorated with avariety of chemical modifications. The structural diversity of the modified nucleosides provides regulatory potential to sort groups of RNAs for organized metabolism and functions, thus affecting gene expression. RNA N6-methyladenosine (m6A) has emerged as amultifaceted controller for gene expression regulation, mediated through its effector proteins - writers,readers,and erasers. The modification “effectors”,includingenzymes(“writers”and“erasers”) that alter the modification level and binding proteins (“readers”) that recognize the chemical marks.

Atthough both DNA and proteins are subject to reversible chemical ‘tuning’, as we pointed out in 2010, a similarprocess on mRNA or other forms of RNA as the third component of the central dogma had been missing, RNA has crucial roles in biological systems not only by passing genetic information from DNA foprotein but also by regulating various biological processes.The diverse functions of RNA are accompanied by more than100 chemical modifications ,although the functions of most of these RNA modifications have remained a mystery. The central role of RNA in gene expression and the intrinsic chemical reversibility of certaintypes of RNA methylation prompted us to raise the question of reversible RNA modifications in gene expression regulation.

m6ARNA methylation in eukaryotes Discovered in the1970s, m6A is the most prevalent internal modification in polyadenylated mRNA sandlong non-coding RNAs(IncRNAs) in higher eukaryotes. m6A is widely conserved among eukaryotic species that range from yeast, plants, flies to mammals, as well as among viral RNAs with a nuclear phase. The identified sequence content of m6A— obtained from mutational studies and substrate preference of the methyltransferase enzyme in vitro—is [G/A/U][G>A]m6AC[U>A>C].The total amount of m6A in RNA can be probed by several methods,including two-dimensional thin layer chromatography, dot-blot and high-performance liquid chromatography coupled with triple-quadrupolet and emmassspectrometry(HPLC-QqQ-MS/MS)

不同种类表观遗传学修饰之间相互影响

• 表观遗传修饰从多个水平上调控基因表达，而不同水平的调控之间也是相互关联的，任何一方面的异常都可能影响到其他水平的表观送传修饰。事实上不同水平的表观遗传修饰在真核细胞中构成了一个完整的表观进传调控网络

• miRNA的表达受甲基化和其他表观进传机制的调控。最初认为不同肿瘤细胞中的miRNA的表达异常是缺失或者突变的结果，但是一些最新研究显示miRNA的表达也会受到甲基化和其他表观遗传机制的影响。

  • siRNA诱导DNA的甲基化 ：SiRNA诱导的转录水平基因沉默是通过指导基因组 表观修饰完成的，包括指导基因组DNA甲基化和指导组蛋白修饰，SiRNA指导的DNA甲基化具有精确特定的靶向性，在某种程度上与肿瘤细胞中抑癌基因特定 沉默过程有关。

肿瘤与表观遗传学 CancerEpigenetics

参考文献：

Cancer Epigenetics: From Mechanism to Therapy

Since the discovery of the first recurrent mutations in oncogenes and tumor suppressorgenes, it has been clear that cancer is,in large part,a genetic disease.

Global changes in the epigenetic landscape are a hallmark of cancer.

概念：研究没有DNA序列变化、可遗传的基因表达(活性)调控方式的改变，主要涉及DNA甲 基化作用的改变和染色质组重白的修饰作用、染色质重曙及非编码RNA等调控方式的变化， 通过引起肿瘤遗传学途径中基因的失能与获能、增加基因组不稳定、印迹于失等途径人参 与肿瘤的发生发展。

• Roles of microRNAs in cancer

  Recent studies show that some microRNAs regulate cell proliferation and apoptosis,processes that are important in cancer formation. Inaddition,some miRNAs may function as oncogenes or tumor suppressors. More than 50% of miRNA genes are located in cancer associated genomic regions or in fragile sites.

第二次课：组蛋白泛素化

如何看待表观遗传学

基因组⇆表观遗传修饰⇆环境

基因组、表观遗传组、基因表达调控与基因执行功能的互作

组蛋白泛素化的功能

1、调节染色质的结构与功能

招募核小体到染色质、参与X染色体失活、影响基因转录、影响其他组蛋白修饰、DNA损伤修复

2、组蛋白降解

细胞内蛋白质的命运：

真核细胞内蛋白质的降解途径：

溶酶体途径、胞液蛋白酶水解途径、线粒体蛋白酶、泛素蛋白酶体途径

01 泛素-蛋白酶体系统的组成：

（一）泛素

是一种高度保守的含76个氨基酸（8.6kDa）的蛋白，因广泛分布于各类细胞而得名，能通过泛素化过程共价连接许多细胞蛋白。

氨基酸序列

类球状结构：

β-抓握折叠

基因：

RPS27A（UBA80/UBCEP1）、UBA52（UBCEP2 ）、UBB、UBC

编码两种类型的泛素前体蛋白质：

泛素融合蛋白（与核糖体蛋白S27a或L40融合），多聚泛素

最终形成泛素单体

连接：

可以作为单个单位（单泛素化）或作为支链（聚泛素化）连接底物。

泛素间通过7种不同的泛素赖氨酸残基进行连锁（Lys 6/11/27/29/33/48/63），N端的Met1也可以进行连接。

在泛素蛋白与其他蛋白相连之前，其C端的甘氨酸残基必须被活化

当一个泛素的赖氨酸残基连锁至另一个泛素的羧基末端甘氨酸时会形成聚泛素链

（二）泛素化修饰过程与泛素化酶

泛素化：

泛素与底物蛋白共价结合的过程，是一个由3类酶进行的依赖于ATP的过程

泛素化酶：

1. 泛素激活/活化酶（E1） E1与泛素形成一个硫酯键，依赖于ATP，激活泛素分子后将其送到E2上

2. 泛素偶联酶（E2）E2与泛素结合，“泛素载体蛋白”，把泛素分子绑在被降解的蛋白质底物上。

3. 泛素连接酶（E3）E3在泛素羧基末端和底物蛋白赖氨酸残基的ε氨基之间形成异肽键，辨认被降解的蛋白质。

人类仅有2种E1，约40种E2，但存在有数百种E3，每种E3仅修饰一个底物蛋白亚组，从而为系统提供底物特异性。

底物上的泛素连接点：

泛素C末端常通过酰胺键与靶蛋白的氨基团连接在一起，最常见的连接是与靶蛋白赖氨酸的氨基团相连，也可以与靶蛋白的N端相连。最近发现，也可以与靶蛋白上的半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸相连。

E3连接酶：

可以根据特征结构域以及泛素分子到底物蛋白的传递过程分为3个主要的家族：

1、RING；2、HECT；3、RBR；4、RING-Cys-relay(RCR)

E3对底物的选择机制：

1. 底物蛋白本身有特殊序列可以被E3识别

2. 底物蛋白经翻译后修饰可以被E3识别

3. E3或复合体的某些成份经修饰后翻译可被活化，识别第五

4.  一些蛋白与辅助蛋白结合后可被识别

泛素化过程：

在ATP参与供能下，E1催化泛素分子C末端的甘氨酸形成泛素-腺苷酸中间产物，C末端被E1腺苷酰化，随后被激活的泛素C末端与E1半胱氨酸残基形成高能硫酯键。

随后通过转酰基作用，泛素分子由E1转移至E2活性位点中的半胱氨酸残基，形成E2-泛素巯基酯

大多数情况下，E3在识别靶蛋白底物的过程中起到了关键性作用，底物被E3特异性识别，E3招募E2使之与底物蛋白接近，然后被活化的泛素蛋白被在E3的共同作用下与底物结合。

多泛素链的形成：

一个泛素蛋白分子的赖氨酸侧链与另一个泛素蛋白的C端相连，如此反复形成多泛素链。泛素蛋白含有7个赖氨酸残基，所有残基都可以参与合成。

E4酶：

泛素链延长因子，可以催化已经形成的多泛素链结合到底物蛋白上。

不同位点的泛素连接空间结构有区别：

混合泛素化、分支混合泛素化

（三）蛋白酶体

26S蛋白酶体

大分子量复合体，~2MD

真核细胞内的蛋白酶体分布于细胞质和细胞核中，有的与内质网或细胞骨架结合，约占细胞蛋白质量的1%。

筒状结构：19S调节亚基/11S调控因子+20S蛋白酶体的降解中心（活性部位）

靶蛋白泛素化后，先被19S亚单位识别，随后脱泛素链和变性，进入20S亚单位的筒状结构内被降解成多肽。

19S调节亚基：ATP水解酶打开底物蛋白的折叠结构，并输送到20S蛋白酶体核心结构。

20S蛋白酶体的降解中心：腔室内侧存在三种蛋白底物降解催化位点，与底物存在物理屏障而不能接触。为到达催化位点，底物必须穿越两端的狭窄孔道。

蛋白酶体本身不具备选择消化蛋白底物的能力，必须由E3识别并泛素化的底物才能被降解。

20S三种活性状态：β1半胱天冬酶样肽溶解酶活性，β2胰蛋白酶样，β5糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶样

免疫蛋白酶体PA28αβ-iCP immunoproteasome/PA28γ

负责抗原提呈，免疫蛋白酶体的催化颗粒20S有三个特殊亚单位LMP2/LMP7/MECL-1，调节颗粒为PA28(11S)

不依赖多泛素化的蛋白酶体降解

蛋白酶体抑制剂：

天然化合物（DCI、Lactacystin、Aclacinomycin、Eponemycin、RP-39）与合成化合物（MLN-519、MG-132、CEP-1612、CVT-634、PS-341）

 

（四）去泛素化与去泛素化酶

可逆性：泛素连接酶E3与去泛素酶DUB主导了蛋白质的泛素化修饰与去泛素化修饰，其动态平衡决定了蛋白质的质量水平、亚细胞精确定位以及其他蛋白质的相互作用，因此影响了细胞信号转导的正常进行。

（五）类泛素蛋白

“小泛素相关修饰物”(Small Ubiquitin- related MOdifier)SUMO化:是类泛素样蛋白家族的成员。

SUMO 可使用 E1、E2F3 偶联系统以一种类似于泛素化的方式共价连接蛋白。

但不像泛素化，底物蛋白的 SUMO 化通常不会导致降解。相反，SUMO 修饰会影响亚细胞定位、蛋白功能或蛋白间相互作用。 SUMO化有许多细胞作用，包括胞核转运，转录活性调节和蛋白质稳定性。

SUMO化与其他翻译后修饰(如泛素化、磷酸化和乙酰化)之间的相互作用是一个活跃的研究领域.

与泛素蛋白一样，UBL蛋白都是通过共价连接的方式连接到靶生物大分子(大部分是蛋白)上从而对其进行修饰的。

泛素系统可以对酵母细胞中超过1000多种的不同蛋白质进行修饰，有一些UBL修饰途径，比如SUMO(小类泛素修饰因子)修饰途径的靶蛋白非常多，而且靶蛋白之间差异非常大。

而另一些UBL修饰途径的靶蛋白范围则非常有限，比如UBL蛋白酵母蛋白Atg12似乎只有一个靶蛋白Atg5，Atg8蛋白只与一种特殊的磷脂–磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)相结合。

哺乳动物类泛素蛋白与泛素具有相类似的三维核心结构即β-抓握折叠(β-grasp fold)。

哺乳动物类泛素蛋白Ubl5 和 Urm1B功能尚未知

原核生物的类泛素蛋白Pup(prokaryotic ubiquitin-like protein)

与哺乳动物泛素相比,原核生物的类泛素蛋白原素虽并不具有 B-抓握折叠,但其修饰方式和功能与泛素类似。

02-组蛋白泛素化

组蛋白单泛素化

E3 ligase:

1. H2A-specific: RING1A/RING1B/BMI1; BRCA1/BARD1 ;2A-HUB

2. H2B-specific: RNF20/RNF40 ; BAP250b/Elo; BC/CUL2/RBX1; Brel/Rad6

DUB:

1. H2A-specific: USP16; USP21 ;BAP1; 2A-HUB

2. Common to H2A/H2B: USP3; USP12/46 ; USP22

3. H2B-specific: USP7; SCNY; Ubp8; Ubp10

• 组蛋白残基动态修饰的交叉调控：不同组蛋白修饰相互关联,甚至可以形成多种信息性的“密码”,被称为“组蛋白密码”。

  1. 原位串扰:同一修饰位点的不同组蛋白修饰之间存在竞争性的相互抑制

  2. 顺式调控：同一组蛋白的不同修饰位点间存在互相抑制

  3. 反式调控：不同组蛋白的不同修饰位点间存在相互抑制

• 组蛋白泛素化对转录的影响：

  (1)改变染色质结构，影响DNA暴露而调节转录

  (2)作为一种募集调节因子的信号

  (3)影响其他组蛋白修饰而调节转录—可能性最大

• Polycomb Group(PcG)

  一组通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制因子,从生化和功能上分为两个主要的核心蛋白复合物:

  • PRC1(Polycombrepressivecomplex1) RING1B:催化活性(H2A-K119Ub)

  • PRC2(Polycomb repressive complex2) EZH2:催化活性 (H3K27me2/3)

  • 不仅控制个体正确的发育模式，且与细胞增殖、分化和肿瘤发生、干细胞命运的决定等客切相关。

  • Poelycemb proteins form chromatin modifying enzyme complexes that repress transcription

• H2AK119-Ub

  PRC1(Polycomb repressive complex 1)为主要复合物。该复合物为发育调控过程中基因转录抑制的重要因子，主要参与Hox基因沉默。其中，RING1B为参与泛素化H2A的E3连接酶。与NCoR/HDAC1/3复合物相互作用的2A-HUB/hRUL138也参与催化组蛋白H2A赖氨酸119单泛素化修饰，并与巨噬细胞趋化因子基因表达抑制有关。

  • (1)负性调节转录 Rad6和Brel是在啤酒酵母中最早被鉴定的催化单泛素化的相关酶类。

    Rad6(E2)—–HR6A、HR6B

    Brel(E3)—–RNF20、RNF40

    Rad6对H2B的泛素化对常染色质基因ARG1的沉默非常重要。

    当精母细胞缺失HREB会过早表达精子细胞特异性单拷贝和多拷贝的X相 关基因，说明HR6B可能通过泛素化H2B参与维持精母细胞和精子细胞内 染色体沉默。

    敲除人类的Bre1同源物RNF20会引起细胞EGF表达升高，提示RNF20可 能参与基因转录抑。uH2B还可通过稳定在抑制性基因启动子区的核小体来调节转录起始。

  • (2)正性调节转录

    SAGA调节基因GAL1、SUG2和PHO5的活化依赖的泛素化介导H2B- K123的泛素化。

    过表达RNF20增强p53对靶基因p21和MDM2的诱导，而敲低RNF20则减 弱这两个启动子的活性。

    在酵母细胞中Rad5和Brel与基因转录延伸密切相关。

    一些转录延伸的体外实验发现可UH2B能协助组蛋白伴侣FACT刺激RNA 聚合酶1通过核小体从而促进基因转录。

• 组蛋白H2B单泛化与肿瘤

  对H2B的E3连接酶RNF20的研究提示H2B的泛素化具有肿瘤抑制作用。

  RNF20的缺失会引起肿瘤抑制因子pP53表达大幅度下降

  抑制RNF20的表达会引起白血病细胞生长的抑制。

  升高H2B的泛素化水平可能有利于肿瘤的治疗，但是有些研究人员却对

  H2B泛素化的肿瘤抑制作用持相反观点，认为UH2B也有可能促进肿瘤形

  成，比如敲低和会减弱肿瘤细胞增殖。

• 组蛋白多泛素化降解

  • RNE8介导组蛋白H3K4的多泛束化修饰与蛋白酶体降解

  • H2BK120多泛素化修饰的26S蛋白酶体降解途径

• DNA损伤修复过程中的组蛋白泛素化

  H2AX(histone family 2A variant,H2A1,H2A2,H2AZ,H2AX)

  Y-H2A.X(p-Ser139):迄今所研究的最重要的DNA损伤感应分子。发生DNA双联断裂后，迅速磷酸化

• DNA损伤修复过程中的组蛋白降解

  Cheblal et al. show that DNA damage checkpoint-induced histone depletion enhances the homology search for a resected chromosome break for its homologous donor.

  乙酰化依赖的非ATP蛋白酶体降解途径

• 组蛋白的类泛素化修饰

  • H2A NEDDylation: 与H2A泛素化之间具有持抗关系，可调控DNA损伤修复。

03泛素-蛋白酶体通路与药物研发

（一）靶向泛素-蛋白酶体系统的小分子抑制剂

1. 靶向E1/E2/E3的抑制剂

靶向MDM2-p53相互作用进入临床试验的抑制剂:Mk-8242;SAR-405838;APG-115;RO-5045337;RO-5503781;DS-3032;CGM-097

结合类型 可逆/非可逆

给药途径 口服

临床阶段 I期

1. 靶向泛素链的抑制剂

 Ubistatin A：核磁分析显示其结合在以K48成链的泛素分子的接触面，改变泛素链

的空间构想，导致蛋白酶体不能识别。

1. 靶向去泛素化酶的抑制剂

• DUB：通常以活性形式表现出来，一般具有高度特异的底物及明确的催化口袋，利于设计和开发小分子抑制剂。

• WP1130：以JAK2为靶点而意外获得，抑制USP9X、USP5、USP14和UCH37活性，从而促进一些促进细胞存活的蛋白的降解，但抑制DUB的机制不清

（二）PROTAC技术

（也能直接实现对目标蛋白的降解）

实际在临床上也有部分药物被意外发现具有降解靶蛋白的作用：

1. 比如乳腺癌治疗药物氟维司群可以降解雌激素受体；

2. 来那多胺可以特异性降解转录因子IKZF1和IKZF3；

3.  第三代EGFR抑制剂奥希替尼也能选择性诱导EGFR-T790M的降解。这些意外的发现没有普适性，也较难通过合理设计来得到。

直接在蛋白水平靶向泛素化降解蛋白策略：利用嵌合双分子分别连接底物蛋白与E3泛素连接酶，借用自身UPP系统降解靶蛋白的方法，招募E3连接酶对目的蛋白进行多泛素化，从而介导蛋白经由泛素-蛋白酶体途径实现降解。具有高效、高选择性。

基于肽段E3招募模块的PROTACs。【多肽，细胞渗透率差】

基于小分子E3招募模块的全小分子PROTACs。

细胞可穿透的PROTAC

•  PROTACs已经成功靶向降解的蛋白从最早的甲硫氨酰氨肽酶2、雄激素受体（AR）、细胞视黄酸结合蛋白等，到最近的雌激素受体（ER）、Tau微管相关蛋白、激酶类等。涉及的疾病包括癌症、类风湿、神经退行性疾病等，展现出良好的应用前景。部分PROTACs研究成果已进入临床应用，如Arvinas公司的两个口服PROTAC（AVS-110，AVS-378），当前已进入Ⅰ期临床试验，用于治疗耐雄激素限制疗法的转移性前列腺癌和乳腺癌。

• PROTACs的优点是可以有效地抑制目标蛋白，又可以快速降解清除。但不足是它的高分子量导致其水溶性、口服吸收和透膜性都较差，临床应用中化学合成成本较高。其脱靶毒性更是值得关注。

• PROTACs 与小分子抑制剂比较的优势

  1.  靶向“无法成药”的蛋白质（不需要结合靶蛋白的活性位点）

  2. 用药量相对较少

  3. 靶向降解突变蛋白（Kras等）

  4.  缓解耐药性问题（降解而非抑制）

  5.  利用利用E3 ligase进一步提升亲和力、选择性和安全性

• PROTACs PROTACs的问题

“成药性”（分子量较大）； “抗药性”（泛素连接酶变异）；适宜的泛素连接酶

• 降解蛋白方式

  1. RNA-PROTACs降解RNA结合蛋白

  2. 利用蛋白酶体上的DUB酶的小分子配体降解蛋白

  3. 分子胶

  经典的分子胶降解剂如沙利度胺类似物和芳基磺酰胺类抗癌药Indisulam等都是利用E3泛素连接酶与靶蛋白之间的互补蛋白-蛋白作用界面，重编程泛素连接酶的选择性，以催化剂的方式驱动靶点泛素化。同时分子胶相比PROTAC有更小的分子量，理论上会有更好的成药性。早期发现的分子胶也多是偶然所得，近年来主动设计的分子胶也取得了不错的进展。沙利度胺类抗癌药物是分子胶的一个显著例子，这类药物可重定向E3泛素连接酶CRL4CRBN，从而使转录因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，导致IKZF1和IKZF3被蛋白酶降解。类似地，抗癌磺胺类药物indisulam可引导CRL4DCAF15 E3泛素连接酶降解剪接因子RBM23和RBM39。

04 泛素化的研究方法与常用实验技术

 常用试剂：MG132; CHX; 表达质粒（Ubiquitin，因子，wt/mutation）

 常用实验方法：Western blot and immunoprecipitations

通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。

 常用抗体：Anti-Ubiquitin; anti-Ubiquitin, Lys63 specific; anti-Ubiquitin, Lys48 specific; antiH2B K120Ub； anti-H2A K119Ub…

 常用研究策略

组蛋白修饰的检测方法

① 染色质免疫共沉淀（ChIP）

② 染色质免疫共沉淀结合Real-time

③ 染色质免疫共沉淀结合芯片（ChIP on chip）

④ 染色质免疫共沉淀结合测序（ChIP Seq）